Bewertung funktioneller Futtermittelzusatzstoffe gegen Garnelenpathogene mit Schwerpunkt auf Vibrio parahaemolyticus und White Spot Syndrome Virus (WSSV) in Litopenaeusvannamei

von Farshad Shishehchian, KritKhemayan, Zahra Javidi, Blue Aqua International Unternehmensgruppe, Thailand

Die Aquakultur von Garnelen wurde dramatisch von vielen pathogenen Krankheiten betroffen, hauptsächlich verursacht durch V. parahaemolyticus und das White Spot Syndrome Virus (WSSV). Ziel dieser Studie war es, den potenziellen Einsatz von zwei funktionellen Futtermittelzusatzstoffen AlphaGuard*L Plus (Flüssigkeit) und AlphaGuard*P (Pulver) bestehend aus ätherischen Ölen (Eukalyptus, Thymian, Oregano, der zur Familie der Myrtaceae bzw. Lamiaceae gehört), Mittelkettige Triglyceride (MCTs) und natürliche bioaktive Verbindungen in Garnelen gegen Krankheitserreger, insbesondere V. parahaemolyticus und WSSV.

Die Ergebnisse zeigten, dass AlphaGuard*L Plus den Krankheitsverlauf bei Garnelen wirksam verzögerte. Diese Ergebnisse legen nahe, dass der funktionelle Futtermittelzusatz von AlphaGuard*P und AlphaGuard*LPLUS verwendet werden könnte, um die Abwehr von Garnelen gegen Krankheitserreger zu fördern.

Einführung

Die Intensivierung der Aquakultur wird durch Gesundheit und Ernährung behindert, die die Wachstumsleistung beeinträchtigen. Um diese Konsequenzen zu entwirren, funktionelle Futterzusätze wurden verwendet, um das Immunsystem von Garnelen zu stimulieren und die Leistung von Garnelen zu verbessern, insbesondere um virale und bakterielle Krankheitserreger zu bekämpfen, bei der Behandlung von Garnelenkrankheiten wie V. parahaemolyticus, die akute hepatopankreatische Nekrosekrankheit (AHPND) und das Weißflecken-Syndrom (WSSV) verursachten, das Weißflecken verursachte Krankheit (WSD), kombiniert mit der Umsetzung von Biosicherheitsmaßnahmen.

Die Zusammensetzung von AlphaGuard, bestehend aus MCT und ätherischem Öl, wird als GRAS-Praxis anerkannt. In dieser Studie, die Wirksamkeit des AlphaGuard-Produkts wurde durch eine Kombination der Daten aus den Ergebnissen von Scheibendiffusionstests ermittelt, Krankheitsherausforderungen und Histologie, zusammen mit einer Bewertung der Auswirkungen von AlphaGuard-Produkten auf die Garnelenkrankheiten.

Materialen und Methoden

Krankheitserregende Bakterien und Viren
Zwei virulente Krankheitserreger bei Garnelen, V. parahaemolyticus und V. harveyi in Glycerinvorrat, wurden in Tryptic Soy Broth (TSB) + einem Prozent NaCl subkultiviert, 24 Stunden bei 37 °C inkubiert, bevor er auf Thiosulfat-Citrat-Gallensalze-Saccharose-Agar ausgestrichen wurde, um seine Reinkultur zu erhalten.

WSSV-Suspension wurde aus dem Muskel von WSSV-infizierten Garnelen hergestellt. Knapp, das WSSV-enthaltende Garnelenmuskel wurde bei -80°C aus dem Lager genommen und unter kalten sterilen Bedingungen in gleichförmige Stücke geschnitten, dann in TN-Puffer (20 mM Tris-HCl, 400 mMNaCl, pH 7,4) bei 0,1 g/ml.

Nach Zentrifugation bei 2, 000 U/min für 10 Minuten bei 4°C, der Überstand wurde mit 0,9% NaCl auf 1:100 verdünnt und durch 0,45 Mikron filtriert. Der resultierende Überstand wurde bei –80°C gelagert, bis es als Quelle für die WSSV-Injektion für die Challenge-Experimente verwendet wurde.

Die antimikrobielle Aktivität

Scheibendiffusionstest
5 µl von AlphaGuard*L Plus und AlphaGuard*P, Konzentration von 0, 0,25, 0,5, 1,0 und 10 % Verdünnung mit NaCl 0,85 %, wurden in fünf Millimeter Durchmesser absorbiert, 0,9 mm dicke Papierscheiben werden dann luftgetrocknet, bevor sie in 105 Zellen einer Bakterienkultur in einer 100 x 15 mm breiten Petrischale platziert werden. Als Negativkontrolle wurde 0,85 % NaCl-Lösung verwendet. Drei Wiederholungsplatten für jede Behandlung wurden verwendet und die Beobachtungen wurden nach 24 Stunden aufgezeichnet.

Künstliche Infektion mit V. parahaemolyticus und Bestimmung der Anzahl von Vibrio in Garnelenhämolymphe (HL) und Hepatopankreas (HP)

V. parahaemolyticus wurde aus der Lagerung bei –80°C reaktiviert und in TSB + 1 % NaCl bei 37°C über Nacht kultiviert. Die Kultur wurde bei 5 zentrifugiert, 000 U/min für 10 Minuten, den Überstand entfernen, und das Pellet wurde in sterilem 0,85 % NaCl auf eine Dichte von 8,4 × 10 6 CFU/ml resuspendiert.

Die Krabbe, in der fünften Woche, wurden durch Injektion von 100 &mgr;l der Bakteriensuspension in das zweite Bauchsegment gesunder Garnelen in der fünften Kulturwoche infiziert, und die Mortalität wurde sieben Tage lang aufgezeichnet.

Garnelen wurden zufällig am dritten Tag nach der Infektion für jede Behandlung gesammelt und dreimal mit sterilem Wasser gewaschen. HL wurde unter sterilen Bedingungen mit einer sterilen Ein-ml-Einwegspritze aus der Perikardhöhle entnommen und zu einem gleichen Volumen eines sterilen Antikoagulans (Zugabe von 10 mM EDTA-Na2 zu 450 mMNaCl, 10 mMKCl, 10 mM HEPES, pH-Wert 7,3, 850 mOsm.kg-1 oder 10 mM Tris-HCl, 250 mM Saccharose, 100 mM Natriumcitrat, pH-Wert 7,6).

Das HL und das gemahlene HP wurden seriell 10-fach mit kaltem sterilem PBS verdünnt. Jede Verdünnung wurde auf TCBS-Agarplatten ausgestrichen, die mit der Oberseite nach unten in einen Inkubator bei 37 °C gelegt und 16–20 Stunden kultiviert wurden. Platten mit 30–300 Bakterienkolonien wurden gezählt, dann wurden die Zahlen als KBE/ml oder KBE/g aufgezeichnet.

Künstliche Infektion mit WSSV

ml des Filtrats wurden gesunden Garnelen in der fünften Kulturwoche intramuskulär injiziert. Garnelen wurden sechs Stunden nach der Infektion zufällig zur histopathologischen Untersuchung gesammelt und die Mortalität f wurde sieben Tage lang aufgezeichnet.

Wachstumsbedingungen und Versuchsgruppen für Garnelen

Garnelen wurden von lokalen thailändischen Farmen gekauft. Sie wurden negativ auf V getestet. parahaemolyticus-verursachte AHNPD und WSSV durch PCR-Analyse. Nach einer Woche Akklimatisation im Aquarium vor dem Versuch, anscheinend gesunde Garnelen mit einheitlicher Körperlänge wurden nach dem Zufallsprinzip in drei Gruppen mit sechs Wiederholungen pro Gruppe eingeteilt, 20 Garnelen pro Replikat.

Die Aquarienkapazität betrug 100 Liter, 60 Liter Meerwasser enthalten. Die Salzwassereigenschaft wurde bei 15 ppt gehalten, pH 7,7-8,0 und DO> 4,0 mg/l. Jede Behandlung enthält juvenile Garnelen mit einem durchschnittlichen Anfangsgewicht von 2,6 g, die zufällig in jedem Becken gelagert werden.

Garnelen wurden bis zu einer Sättigung von bis zu 2,5-3 Prozent ihres Körpergewichts verfüttert. fünf Wochen lang dreimal täglich. Fütterung wurde täglich angepasst, nach ihrer eingenommenen Rate, um sicherzustellen, dass das Futter vollständig verzehrt wurde. Vor dem Füttern, Häutungen, Kot, und tote Garnelen wurden entfernt, Alle drei Tage wurden 20 Prozent des Wassers in jedem Tank durch neues Meerwasser ersetzt.

Versuchsdiäten und Datenerhebung

Alle Gruppen wurden gehalten, während des Experiments, unter den gleichen Bedingungen wie die Akklimatisierung. Die Kontrollgruppe wurde mit handelsüblichen Garnelenpellets gefüttert, beschichtet mit einem Prozent Chitin-Chitosan. Behandlungsgruppen wurden mit AlphaGuard*L Plus aufgesprüht oder AlphaGuard*P gefüttert, gemischt mit handelsüblichen Garnelenpellets und beschichtet mit einem Prozent Chitin-Chitosan, bei Dosierung 5,0 ml oder g/kg Futter. Sterblichkeits- und Wasserqualitätsparameter wurden täglich aufgezeichnet. Am Ende des Prozesses, die Überlebensrate wurde ausgewertet.

statistische Analyse

Statistische Analyse Versuchseinheiten, Panzer, und Aquarien wurden vollständig randomisiert verteilt. Die quantitativen Daten wurden auf Normalität und Homoskedastizität überprüft. Die Daten wurden unter Verwendung einer Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) analysiert, um nach signifikanten (p <0,05) Unterschieden zwischen den Behandlungsmittelwerten zu suchen.

Ergebnisse

Die antibakterielle Aktivität durch Scheibendiffusionsmethoden und die Aufnahme in die Garnelendiät auf die Krankheitsresistenz von AlphaGuard*L Plus oder AlphaGuard*P

Scheibendiffusionstest

Die Konzentrationen von AlphaGuard*L Plus und AlphaGuard*P hemmen mindestens ein Prozent sowohl V. harveyi als auch V. parahaemolyticus, jedoch, V. parahaemolyticus zeigte eine höhere Hemmwirkung als V. harveyi. Die effektive Konzentration von AlphaGuard könnte verringert worden sein, wenn wir in fettlöslichen Stoffen verdünnt hätten, wie Ethanol, zum Prüfen.

Kompositionen aus ätherischen Ölen, Assay-Techniken und die Wirkungsweise wurden intensiv überprüft. In dieser Studie wurden die Mechanismen nicht im molekularen Detail untersucht, jedoch, die Hauptwirkung der bakteriziden Eigenschaften könnte mit ihrer Beeinträchtigung der Membranintegrität und -permeabilität als lipophile Verbindung aus ätherischen Ölen und MCTs zusammenhängen.

Verschiedene Fettsäuren in MCTs haben eine unterschiedliche minimale Hemmkonzentration (MHK), je nach Art der Fettsäure, Mikroorganismus, und Umgebungs-pH. Der synergistische und antagonistische Aspekt zwischen den Inhaltsstoffen in AlphaGuard wird in dieser Studie nicht erläutert. Das ätherische Öl in AlphaGuard wirkt auch als Antioxidans, um die Oxidation von ungesättigten MCTs zu verhindern oder zu verlangsamen, um deren Haltbarkeit zu verlängern, neben Anti-Stress bei Garnelen.

V. parahaemolyticus-Provokationstest

Am Ende des Futterversuchsversuchs Garnelen wurden durch V. parahaemolyticus herausgefordert. Die kumulative Sterblichkeitsrate wurde aufgetragen (siehe Abbildung 2). Die Ergebnisse der Sterblichkeitsrate, nach der V. parahaemolyticus-Challenge für ein siebentägiges Intervall, zeigten, dass Gruppen von Garnelen, die mit AlphaGuard*P und AlphaGuard*L Plus gefüttert wurden, nach dem vierten Tag der Infektion signifikant niedrigere Sterblichkeitsraten aufwiesen als die Kontrollgruppe.

Sowohl AlphaGuard*P als auch AlphaGuard*L Plus hatten nach dem fünften Tag der Infektion dieselbe statistische Sterblichkeitsrate. Am Ende des Experiments, im Gegensatz, die Überlebensrate korrelierte statistisch nicht mit der Sterblichkeitsrate für AlphaGuard*P, (siehe Abbildung drei).

Die Fähigkeit zur Beseitigung von Garnelen von Vibrio spp. nach drei Tagen Infektion wurde eingezeichnet, (siehe Abbildung vier). Die Ergebnisse zeigten, dass die Vibriospp. Die Hämolymphe der Garnelen, die mit AlphaGuard*P und AlphaGuard*LPlus gefüttert wurden, war niedriger als in den Kontrollgruppen. Die Fähigkeit von Garnelen, sich gegen Bakterien in HP zu verteidigen, gefüttert von AlphaGuard*LPlus, hatte auch eine viel bessere Verteidigungsfähigkeit als Garnelen, die nicht mit AlphaGuard gefüttert wurden.

WSSV-Herausforderungstest

Der WSSV-Challenge-Test wurde nach fünf Wochen des Fütterungsversuchs durchgeführt. Die kumulative Sterblichkeit wurde aufgetragen, (siehe Abbildung 5). Die mit AlphaGuard*L Plus gefütterte Gruppe von Garnelen zeigte eine signifikante Verzögerung der Sterblichkeit, im Vergleich zu den Kontrollgruppen und AlphaGuard*P-gefütterten Garnelen während ihrer zweiten, dritter und vierter Tag, (siehe Abbildung 6).

Dies fällt mit keinem histopathologischen Zeichen einer H&E-Färbung von WSSV-Infektionsgewebe im Injektionsbereich zusammen. mit Ausnahme der Generalisierung von Muskelnekrose, die wahrscheinlich mit dem Abwehrmechanismus der Garnelen nach drei Tagen Infektion zusammenhängt. Nichtsdestotrotz, alle Gruppen endeten mit einer Sterblichkeit von 100 Prozent.

Abschluss

Die Ergebnisse dieser Studie legten nahe, dass die Anwendung von AlphaGuard*P und AlphaGuard*L Plus Futtermittelzusatzstoff in einer Menge von 0,5 Prozent mit kommerziellem Futter die Wirksamkeit bei der Förderung der Garnelenabwehr gegen Krankheitserreger bewies. Insbesondere AlphaGuard*L Plus zeigte eine bessere Performance.