Die Subtilisin-like Proteinase (AprBp) von Bacillus pumilus 3-19 ist ein vielversprechender Kandidat für die industrielle Verwendung als Futtermittelzusatzstoff. Jedoch, um eine hohe Ausbeute des Enzyms zu erhalten, es ist notwendig, ein hocheffizientes Expressionssystem zu entwickeln.

Ziel der Studie war es, eine stabile Expression des B. pumilus 3-19 Protease-Gens im Pichia pastoris-Expressionssystem zu erhalten und die Korrelation der Enzymaktivität mit der Wahl des Vektortyps und der Signalpeptide zu bewerten. In dieser Studie, zur stabilen Expression des optimierten Protease-Gens in methylotrophen Hefezellen, die Vektoren pPINK-HC und pPINK-LC wurden ausgewählt. Für die extrazelluläre Sekretion von rekombinanter Protease, ein Satz wirksamer Signalpeptide wurde verwendet. Die Präsequenz des α-Mating-Faktors hat wiederholt zu einer erhöhten Sekretion rekombinanter Proteine ​​geführt. Auf der anderen Seite, die Sequenzen von Killer- und Lysozym-Signalpeptiden wurden bisher nicht für die Expression von bakterieller Protease in P. pastoris verwendet.

Kolonien von Transformanten mit Konstrukten basierend auf dem pPINK-LC-Vektor wurden am 3. Tag der Inkubation nachgewiesen und zeigten eine höhere Transformationseffizienz als für Kolonien mit Konstrukten basierend auf dem pPINK-HC-Vektor, die erst am 7. Tag der Inkubation nachgewiesen wurden. Die Transformationseffizienz am 10. Tag der Inkubation für Strukturen basierend auf dem pPINK-LC-Vektor betrug im Durchschnitt 1,3 × 103 Transformanten/μg DNA, während 1,03 × 10 3 Transformante/μg DNA für Konstrukte mit dem pPINK-HC-Vektor aufgezeichnet wurden. Kolonie-PCR zeigte, dass alle ausgewählten Transformantenkolonien das in das Hefegenom integrierte Subtilisin-ähnliche Protease-Gen enthielten.

Die Studie zeigte, dass die Inkubationszeit die Synthese von Protease in P. pastoris beeinflusst, und die maximale Aktivität des Enzyms wurde beobachtet. Hefestämme mit Konstrukten basierend auf dem Low-Copy-Vektor pPINK-LC zeigten eine höhere Proteaseaktivität (U/ml) bei der Hydrolyse von Azocasein (2,63 ± 0,16 für Killersignalpeptid (SP), 2,49 ± 0,08 für die Präsequenz des α-Paarungsfaktors, 2,19 ± 0,11 für Lysozym-SP) als Stämme mit Konstrukten basierend auf dem pPINK-HC-Vektor (1,86 ± 0,09 für Killer-SP, 2,21 ± 0,07 für die Präsequenz des α-Paarungsfaktors, 1,31 ± 0,11 für Lysozym SP), unabhängig davon, welches Signalpeptid verwendet wurde. Die maximale Proteaseaktivität wurde für Hefestämme mit den Konstrukten pPINK-LC-killer-aprBp (5,75 ± 0,08 U/ml) und pPINK-LC-α-mat.factor-aprBp (4,33 ± 0,07 U/ml) erhalten.

Diese Studie zeigte, dass die Subtilisin-ähnliche Protease aus rekombinanten P. pastoris-Stämmen proteolytische Aktivität aufweist, die von der Inkubationszeit und der Wahl von Signalpeptid und Vektor abhängt. Die Produktion von bazillärer Protease durch das heterologe Expressionssystem auf Hefebasis macht dieses System vielversprechend für die Entwicklung neuer Futtermittelzusatzstoffe für die Tierhaltung.

Proteasen zählen zu den drei größten Gruppen industrieller Enzyme und machen etwa 60 % des weltweiten Gesamtabsatzes von Enzymen aus. 40% davon gehören zu bakteriellen Proteasen. Bakterielle Serinproteasen haben eine breite Substratspezifität, und hohe Beständigkeit gegen verschiedene Bedingungen, was ihren Einsatz in der Biotechnologie rechtfertigt, insbesondere als Bio-Zusatzstoffe für Nutzvögel und Nutztiere. Zusätzlich, Die Ergänzung von Futtermitteln mit Proteasen verbessert die Aufnahme von Aminosäuren durch Tiere und spart Geld für den Kauf von synthetischen Aminosäuren. Es wurde auch gezeigt, dass der Einsatz von Proteasen als Futtermittelzusatz die Bioverfügbarkeit von Stickstoff erhöht, was wiederum die Ammoniakbelastung im Boden reduziert. Ebenfalls, Proteasen erleichtern die Wirkung anderer Enzyme und erhöhen die Wirtschaftlichkeit von Futtermitteln, sowie das Wachstum der nützlichen Mikroflora im Darm von Broilern fördern.

Heute, In Russland wird eine begrenzte Anzahl von kommerziellen Proteasen ausländischer Hersteller verwendet. Hauptvertreter auf dem russischen Markt sind die importierten Futtermittelzusatzstoffe CIBENZA DP100 (NOVUS (88,1%) VEREINIGTE STAATEN VON AMERIKA), RONOZYME® ProAct (DSM (9,4%), Schweiz), Axtra® PRO TPT (DuPont (2,4%), Deutschland). Die erhaltene Rekombinante umfasst P. pastoris-Stämme mit dem Gen für die Subtilisin-ähnliche bazilläre Protease (aprBp) und drei verschiedene Signalpeptide (α-Mating-Faktor, Killerprotein und Lysozym). Eine weitere Expression und Reinigung der Protease aus Hefekulturflüssigkeit und die Untersuchung ihrer biochemischen und enzymatischen Eigenschaften werden helfen, die biotechnologischen Aussichten des rekombinanten Enzyms zu beurteilen.

Lesen Sie mehr über die Studie, Heterologe Expression der Bacillus pumilus 3-19-Protease in Pichia pastoris und ihre potenzielle Verwendung als Futtermittelzusatzstoff in der Geflügelhaltung