von Constantinos C. Mylonas, Projektkoordinator (HCMR, Gree), Birgitta Norberg, Fortpflanzung &Genetik - Atlantic Heilbutt Leader (IMR, Norwegen), Kristin Hamre, Ernährung - Atlantic Heilbutt Leader (NIFES/IMR, Norwegen), Torstein Harboe, Larvenhaltung - Atlantic Heilbutt Leader (IMR, Norwegen), Sonal Patel, Fischgesundheit - Atlantic Heilbutt Leader (IMR, Norwegen; derzeit bei VAXXINOVA, Norwegen) und Rocio Robles, Verbreitungsleiter (CTAQUA, Spanien)

Eine der Arten des EU-finanzierten DIVERSIFY-Projekts, die zwischen 2013 und 2018 lief, war der Atlantische Heilbutt (Hippoglossus hippoglossus). Der Atlantische Heilbutt ist der größte Plattfisch der Welt und kann ein Gewicht von über 300 kg erreichen. Es wird auf Märkten weltweit hoch geschätzt, aber die Verfügbarkeit von wildem atlantischen Heilbutt nimmt ab.

Norwegische Aktien werden als lebensfähig eingestuft, die Fischerei unterliegt jedoch strengen Vorschriften. Dies hat zu einer höheren Marktnachfrage nach Atlantischem Heilbutt geführt, die durch die Fischerei allein nicht gedeckt werden kann.

Der Atlantische Heilbutt (siehe Abbildung 1) ist ein halbfetter Fisch, reich an Omega-3-Fettsäuren, mit einem charakteristischen flockigen weißen Fleisch mit wenigen Knochen. Der kultivierte Atlantische Heilbutt hat einen ausgezeichneten Ruf und wird traditionell als große Fischsteaks oder Koteletts vermarktet. Er kann im typisch skandinavischen Stil geräuchert oder mariniert werden. Diese Eigenschaften führten zur Aufnahme des Atlantischen Heilbutts in DIVERSIFY, als großartiger Kandidat für die Diversifizierung von Fischarten und Produkten in der europäischen Aquakultur.

Die Erforschung und Kultivierung von Atlantischem Heilbutt begann in den 1980er Jahren, und obwohl die jährliche Gesamtproduktion von kultiviertem Atlantischem Heilbutt zunimmt, es erreichte 2017 immer noch nur ~1600 Tonnen (Norwegische Fischereidirektion).

In Europa, Atlantische Heilbuttfarmen gibt es in Norwegen und Schottland. Die gewünschte Marktgröße beträgt 5-10 kg und die Produktionszeit beträgt derzeit vier bis fünf Jahre. Trotz erheblicher Forschungsanstrengungen zwischen 1985 und 2000 der komplizierte Lebenszyklus des Atlantischen Heilbutts hat die Fortschritte in der Aquakultur verlangsamt, und danach wurden nur sehr wenige Forschungsmittel bereitgestellt.

Jedoch, während dieser Zeit haben die Landwirte langsame, aber stetige Fortschritte gemacht, um die Produktionsstabilität zu verbessern, und das Interesse an Käfig- und Landkultur wächst. Die verbleibenden Engpässe für eine erhöhte und stabile Produktion hängen mit einer stetigen Versorgung mit Jungfischen und der Notwendigkeit zusammen, die Produktionszeit zu verkürzen.

Letzteres kann mit der kürzlich erfolgten Einführung einer „allein weiblichen“ Jungtierproduktion erreicht werden. Es wird erwartet, dass dies einen großen Einfluss auf die Produktionszeit hat, da die Weibchen schneller wachsen und später reifen – 80 Prozent der geschlachteten Fische <5 kg sind ausgewachsene Männchen.

Das Projekt DIVERSIFY adressierte diese wichtigen Engpässe mit einer koordinierten Forschungsanstrengung in der Reproduktion, Ernährung und Haltung von Larven und Entwicklung von Impfstoffen. Die Kombination aus biologischem, Die im Rahmen von DIVERSIFY entwickelten technologischen und sozioökonomischen Forschungsaktivitäten sollen die Diversifizierung der EU-Aquakulturindustrie unterstützen und zur Ausweitung der Produktion beitragen, zunehmende Aquakulturprodukte und Erschließung neuer Märkte.

Reproduktion

Die Forschung in unserem Projekt bestätigte, dass wild gefangene Weibchen zuverlässig laichten und Eier von konstant sehr hoher Qualität (>85% Befruchtung) produzierten. Gezüchtete Weibchen produzierten auch Eier von hoher Qualität, wenn ihre Ovulationszyklen identifiziert wurden. und das Strippen wurde kurz vor dem Eisprung durchgeführt (siehe Abbildung 2).

Für die kommerzielle Produktion, sowie Zuchtzwecke, es ist nicht praktikabel, sich auf wild gefangene Weibchen zu verlassen. Jedoch, relativ wenige gezüchtete Weibchen produzierten konsistent Eier mit Befruchtungsraten von>80-85 Prozent. Als Konsequenz, es kann notwendig sein, auch in zukünftigen Zuchtgruppen wild gefangene Brutbestände einzubeziehen, um ein ausreichend breites genetisches Material zu gewährleisten.

Die Plasmakonzentrationen von Sexualsteroiden bei landwirtschaftlichen Züchtern waren ähnlich denen, die zuvor bei Atlantischem Heilbutt berichtet wurden. mit Jahresprofilen nach dem Wachstum und der Reifung der Eierstöcke. Die höchsten 17β-Östradiol (E2)-Spiegel wurden kurz vor dem Laichen aufgezeichnet. Anfang Februar, während sowohl E2 als auch Testosteron (T) während der Laichzeit erhöht blieben.

Es wurden keine Unterschiede in den durchschnittlichen Konzentrationen zwischen wild gefangenen und gezüchteten Weibchen festgestellt. Plasmakonzentrationen der Gonadotropine follikelstimulierendes Hormon (FSH) und luteinisierendes Hormon (LH) wurden erstmals beim Atlantischen Heilbutt dokumentiert.

Die mittleren FSH-Konzentrationen waren während der Vitellogenese relativ stabil, von Oktober bis Anfang Februar, im Einklang mit einer konstitutiven Freisetzung von FSH aus der Hypophyse. Plasma-FSH sank während des Laichens auf niedrige Werte, stieg aber nach Abschluss des Laichens wieder an.

Die LH-Konzentrationen im Plasma zeigten während des Fortpflanzungszyklus große individuelle Schwankungen. aber während des Laichens wurden hohe Werte festgestellt. Dies stimmte mit früher gemeldeten Ergebnissen bei anderen Knochenfischen überein, darunter eine Reihe von Plattfischen.

Die Implantation eines Gonadotropin-Releasing-Hormon-Agonisten (GnRHa) führte bei Weibchen des Atlantischen Heilbutts nicht zu einer signifikanten Verlängerung der Laichzeit. aber eine offensichtliche Synchronisation der Laichzeit zwischen den Individuen wurde beobachtet, da die behandelten Weibchen das Laichen einen Monat vor dem Ausgeben der Kontrollfische abgeschlossen hatten. In der kommerziellen Produktion, Die Synchronisation zwischen Individuen kann von Vorteil sein, da sich der Personalaufwand bei der Eizellenentnahme auf einen relativ kurzen Zeitraum konzentrieren kann (siehe Abbildung 3).

Die Züchter des Atlantischen Heilbutts müssen regelmäßig auf ihren Eisprung überwacht und entkleidet werden. und Eier werden in vitro befruchtet. Deswegen, die Verwendung der GnRHa-Implantation bietet einen logistischen Vorteil für das kommerzielle Brutbestandsmanagement der Art, durch Verkürzung der Laichzeit.

Ernährung

Für die Entwicklung eines Protokolls für die frühe Entwöhnung von Atlantischen Heilbuttlarven, wir fanden 28 Tage nach der ersten Fütterung (dpff) einen großen Unterschied in Bezug auf die Futteraufnahme der Larven bei drei verschiedenen kommerziellen Diäten (siehe Abbildung 4).

Larven, die mit der kommerziellen Nahrung für Meereslarven von Otohime (Japan) gefüttert wurden, hatten nach fünftägiger Fütterung volle Eingeweide. Diese Diät wurde in einem Experiment verwendet, das darauf abzielte, den frühesten Zeitpunkt der Entwöhnung mit 15, 22 und 28 dpff. Die Entwöhnung bei 15 dpff führte zu einer fast 100-prozentigen Sterblichkeit, bei 22 dpff ungefähr 30 Prozent Sterblichkeit und bei 28 dpff, fast null Prozent Sterblichkeit.

Die Schlussfolgerung lautete, dass die Ernährungsmerkmale wichtig sind, um die Futteraufnahme bei Atlantischen Heilbuttlarven sicherzustellen, und dass die Larven nur bei 28 dpff bereit sind, sich mit einem formulierten Futter zu ernähren. Weitere Experimente sind erforderlich, um zu beurteilen, ob die frühen Larven mit dieser Nahrung gut wachsen und sich entwickeln.

Ebenfalls, ein Protokoll für die Produktion von Artemia im Wachstum wurde entwickelt und die Nährstoffzusammensetzung wurde analysiert. Artemia kultiviert für drei Tage auf dem Kulturmedium ORI-culture (Skretting, Spanien) und anschließend mit dem mittleren LARVIVA Multigain (Biomar, Dänemark) hat in vielerlei Hinsicht ein verbessertes Nährwertprofil erhalten.

Das Eiweiß, Gehalt an freien Aminosäuren und Taurin erhöht, Lipid und Glykogen verringert, während das Verhältnis von Phospholipiden (PL) zu Gesamtlipiden (TL) zunahm. Die Fettsäurezusammensetzung verbesserte sich bei einem Versuch, aber nicht bei dem beim Handelspartner durchgeführten. Die Mikronährstoffprofile wurden durch die Kultur von Artemia auf dem ORI-Kulturmedium nicht negativ beeinflusst.

Da frühere Forschungen festgestellt hatten, dass sich Larven, die mit aufgewachsener Artemia gefüttert wurden, zu Jungtieren mit besserer Qualität entwickelten, Larven wurden mit aufgewachsener Artemia gefüttert, verglichen mit konventionellen Artemia-Nauplien in DIVERSIFY (siehe Abbildung 5).

Es gab keine Wachstumsunterschiede, Pigmentierung oder Augenwanderung zwischen den beiden Gruppen und die Nährstoffzusammensetzung der Larven nach dreiwöchiger Fütterung war sehr ähnlich. Die Schlussfolgerung war, dass mit modernen Methoden hergestellte Artemia-Nauplien ausreichende Nährstoffgehalte aufweisen, um den Bedarf der Larven des Atlantischen Heilbutts zu decken.

Ebenfalls, die Hypothese, dass in Rezirkulations-Aquakultursystemen (RAS) aufgezogene Larven eine andere Mikroflora im Darm aufweisen und deshalb, eine unterschiedliche Aufnahme von Nährstoffen haben, wurde untersucht. Jedoch, ausgenommen höhere Konzentrationen des Vitamin-K-Derivats MK6, wir fanden keine Unterschiede in der Nährstoffverwertung zwischen Larven, die in RAS aufgezogen wurden oder durch Systeme strömten.

Schließlich, Jungtiere des Atlantischen Heilbutts (ein Gramm Körpergewicht) wurden mit einer Diät mit fünf PL-Spiegeln gefüttert, die von 9 bis 32 Prozent der TL variierten. Es gab keine Auswirkungen der PL-Spiegel auf das Wachstum oder die Lipidzusammensetzung im Darm, Leber und Muskel, 24 Stunden nach der Fütterung.

Jedoch, Zeit nach der Mahlzeit beeinflusste die Lipidzusammensetzung des Darmgewebes, mit höheren neutralen Lipiden eine und vier Stunden nach der Prandialzeit, und höhere Konzentrationen an polaren Lipiden, Cholesterinester und Ceramid 24 Stunden nach der Prandialzeit, Dies spiegelt die Aufnahme der Lipide früh nach der Mahlzeit wider.

Es scheint, dass Jungtiere des Atlantischen Heilbutts ihre Lipidzusammensetzung unabhängig von der Nahrung regulieren, wenn eine Reihe von PL/Triacylglycerol verabreicht wird. wie in der vorliegenden Studie (siehe Abbildung 6).

Larvenhaltung

Ein Protokoll zur Aufzucht von Artemia-Nauplien wurde entwickelt und beschrieben. Die Verwendung von Artemia im Wachstum während der kritischen Phase der Metamorphose bei Larven des Atlantischen Heilbutts unterschied sich hinsichtlich des Wachstums nicht von der Verwendung von Artemia-Nauplien. Sterblichkeit und Brutqualität. Zusätzlich, die Herstellung von angebauter Artemia war arbeitsintensiv, und hohe Personalkosten können bei der Implementierung dieser Lebendfutterquelle in der kommerziellen Larvikultur unerschwinglich sein.

Die kommerzielle Produktion von Atlantischem Heilbuttbrut erfolgt derzeit in Durchflusssystemen (FT), während es einen wachsenden Konsens gibt, dass ein RAS stabilere Umwelt- und chemische Wasserparameter bieten würde, die zu einer verbesserten Larvenleistung führen würden.

In DIVERSIFY wurden Produktionsprotokolle für Dottersack und erste Fütterungslarven in RAS entwickelt. Es wurden keine Unterschiede im Überleben zwischen RAS- und FT-Aufzucht während der Dottersack-Inkubation festgestellt. Wenn die Systeme einen Monat lang grundiert wurden, Das Larvenwachstum war in der RAS-Gruppe während der ersten Fütterung signifikant höher. In einem der FT-Tanks trat eine hohe Sterblichkeit auf.

Zusammen genommen, Die Ergebnisse legten nahe, dass bei einer angemessenen Konditionierung des RAS, ein stabiles System aufgebaut wird, in dem das Wachstum und das Überleben der Larven so gut wie oder besser als in FT-Systemen mit optimalen Bedingungen. Das RAS war im Vergleich zum FT-System ein stabileres Aufzuchtsystem für Atlantische Heilbuttlarven.

Die metagenomische Charakterisierung der Bakteriengemeinschaften in Aufzuchtgewässern und Larven ergab, dass in den Aufzuchtsystemen mindestens 300-400 verschiedene Bakteriengattungen vorhanden waren. Signifikante Unterschiede wurden in der Mikrobiota-Zusammensetzung der RAS- und FT-Systeme festgestellt:sowohl in Silos als auch in Tanks, und im Wasser und den Larven.

Es wurde keine offensichtliche Korrelation zwischen der Mikrobiota im Wasser und der Mikrobiota der Larven festgestellt. Die Charakterisierung der Mikrobiota-Zusammensetzung liefert wichtige Informationen für die Entwicklung einer probiotischen Behandlung von Atlantischen Heilbuttlarven.

Fischgesundheit

Um einen Impfstoff gegen virale Neuralnekrose für Atlantische Heilbuttlarven zu entwickeln, das Kapsidprotein des Nodavirus wurde in drei verschiedenen Systemen erfolgreich rekombinant exprimiert; E coli, Leishmania tarentolae und in Tabakpflanzen, und wie erwartet gab es eine Variation in der Expressionsmenge zwischen den Systemen.

Zusätzlich, das in Pichia exprimierte rekombinante Kapsidprotein wurde aus dem EU-Projekt TARGETFISH bereitgestellt. Diese vier Expressionssysteme unterscheiden sich darin, wie die exprimierten Proteine ​​posttranslational glykosyliert werden. Durch Konstruktion und Verwendung von E. coli und Leishmania tarentolea, die das grün fluoreszierende Protein (GFP) exprimieren, es konnte durch Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht werden, dass Artemia effizient gefiltert und diese Mikroben aufgenommen hat, und dadurch das beherbergende rekombinante Protein.

Artemia aufgenommenes rekombinantes Nodavirus-Capsidprotein, das von den verschiedenen Systemen exprimiert wird, was durch Immunblotting bestätigt werden konnte.

Das von dem anderen System exprimierte rekombinante Kapsidprotein wurde dann an Artemia verfüttert. die mit 100 dph an atlantische Heilbuttlarven verfüttert wurden. Zehn Wochen später, die Jugendlichen in allen Behandlungsgruppen wurden durch eine i.p. Injektion (siehe Abbildung 7) mit Nodavirus, um die Wirksamkeit zu überprüfen.

Die belasteten Fische wurden acht Wochen nach der Belastung terminiert und durch Echtzeit-RT-PCR, die auf das virale RNA2-Segment abzielte, auf das Vorhandensein von Nodavirus im Gehirn getestet. Zwischen den verschiedenen Behandlungsgruppen konnte kein signifikanter Unterschied festgestellt werden. einschließlich der Gruppe mit rekombinantem Protein, das früher Schutz gezeigt hat.

Dies weist darauf hin, dass die Größe der Fische und die Notwendigkeit, Fische zu sortieren, um große Unterschiede zwischen Individuen in verschiedenen Phasen zum Zeitpunkt der Impfung zu minimieren, ihre inhärenten Grenzen haben und sorgfältig geprüft werden sollten.

Abschließend, obwohl gezeigt wurde, dass Artemia die verschiedenen Formen rekombinanter Nodavirus-Kapsidproteine ​​aufnimmt und akkumuliert und als Vektor für die orale Verabreichung an Larven des Atlantischen Heilbutts dient, die Challenge-Experimente zeigen, dass diese Strategie der Antigenabgabe keinen Schutz gegen eine Nodavirus-Infektion induziert, Zumindest unter den in dieser Studie verwendeten Bedingungen.

Für Atlantischen Heilbutt wurde ein technisches Produktionshandbuch erstellt, das von der Website des Projekts unter www.diversifyfish.eu heruntergeladen werden kann.

Dieses fünfjährige Projekt (2013-2018) wurde vom Siebten Forschungsrahmenprogramm der Europäischen Union gefördert, technologische Entwicklung und Demonstration (KBBE-2013-07 einstufig, GA603121, DIVERSIFIZIEREN).

Das Konsortium umfasst 38 Partner aus 12 europäischen Ländern – darunter neun KMU, zwei Großunternehmen, fünf Berufsverbände und eine Verbraucher-NGO- und wurde vom Hellenic Center for Marine Research koordiniert, Griechenland.